MF1739_3 Procedimientos Experimentales con Órganos Aislados, Tejidos y Células de Animales

CAMPO DE CONOCIMIENTO 1. Procedimientos Experimentales con Órganos Aislados, Tejidos y Células de Animales

SCORM 1. CULTIVOS DE CÉLULAS, TEJIDOS Y ÓRGANOS PROCEDENTES DE ANIMALES

Histología y fisiología celular básica.

- Concepto de morfología y fisiología

- Niveles de organización. Relación entre estructura y función

- Clasificación de los tejidos

Proliferación y diferenciación celular. Adhesión celular.

- Concepto de proliferación y diferenciación celular (especialización)

- Factores reguladores: Señales endógenas y exógenas

- Contacto directo célula-célula. Moléculas de adhesión

Tipos de células básicas y características tanto morfológicas como fisiológicas.

- Célula procariota: estructura y funciones básicas

- Célula eucariota: Organización, estructura y función de los diferentes orgánulos celulares, organización función del núcleo.

- Descripción de algunos tipos de células que se suelen utilizar en cultivos celulares: tumorales, epiteliales, Tejido conjuntivo, Tejido muscular, Tejido nervioso, Sangre, tejidos linfoides y Células madre.

Métodos alternativos al empleo de animales en investigación.

- Ventajas de los ensayos in vitro: Ética y legislación, Control del medio extracelular, Homogeneidad de la muestra, Disminución del gasto y tiempo, objetivables y cuantificables, precisión, reproducibilidad, etc.

- Limitaciones: Excesiva sensibilidad, Límite de producción, Inestabilidad, Validación del modelo, etc.

Obtención de células. Cultivos celulares primarios. Obtención de una línea celular.

- Sistemas para la obtención de células: Banco de células o aislamiento a partir de un tejido

- Métodos de aislamiento del tejido, disección/disgregación

- Requisitos especiales para el cultivo de células primarias

- Ventajas e inconvenientes de la utilización de células primarias.

- Conservación o mantenimiento células primarias. Requisitos especiales para el cultivo de células primarias.

Evolución de las líneas celulares y líneas celulares inmortalizadas. Desarrollo de líneas celulares continuas.

- Tipos de líneas celulares establecidas. Células en monocapa y células en suspensión. Células inmortalizadas y transformadas

- Preparación de las líneas.

- Control de los cultivos celulares (pH, sobrecrecimiento, estado del medio, contaminación, etc.)

- Recuento de células. Preparación de células en suspensión y de células adherentes. Uso del hemocitómetro.

- Subcultivos de células. Curva de crecimiento.

- Métodos para aumentar la producción.

- Ventajas y desventajas de la líneas celulares estables

Bases de datos y bancos de líneas celulares y material biológico:

- Qué es un banco de células

- Bancos internacionales más importantes: American Type Culture Collection (ATCC) y European Collection of Cell Cultures (ECACC), etc.

- Otros bancos de células: Banco Nacional de Líneas Celulares, etc.

Anatomía básica de órganos y tejidos empleados en investigación in vitro.

- Órganos y tejidos más comunes: hígado, corazón, riñón, páncreas, branquias, encéfalo, piel, sangre, etc

- Ingeniería de tejidos

Modelos con órganos y tejidos para procedimientos in vitro:

- Cultivo y baños de órganos

- Órganos perfundidos

- Explantes de órganos

- Órganos reconstituidos

- Ventajas e inconvenientes de los diversos tipos de modelos in vitro

Cultivos de órganos:

- Disección de órganos y tejidos para su extracción.

- Baños de tejidos y órganos. Equipamiento y medios de conservación.

- Obtención de explantes. Tamaño de la muestra, Perfusión de la muestra y equipamiento

SCORM 2. MANIPULACIÓN DE CULTIVOS CELULARES Y CRIOPRESERVACIÓN

Equipos y material empleados en los cultivos de células y su mantenimiento:

- Cabinas de flujo laminar: tipos (vertical y horizontal) y nivel de protección (clase I, II y III)

- Incubadores: mantenimiento del nivel de CO2, temperatura y humedad

- Microscopios: Estándar e invertidos con ópticas de contraste de fases

- Frigoríficos, congeladores (de -20º y -80º C) y equipo de criogenia (unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196º C) de líneas celulares)

- Equipos de esterilización y filtración: autoclaves, esterilización por gas, por calor seco, sistema de filtración, purificación de agua, etc.

- Otros instrumentos: Balanzas, Baño termostático, centrífugas refrigeradas y no refrigeradas, Equipos de purificación de agua, Micropipetas de volumen variable o de volumen fijo, pHmetro, Pipeteadores automáticos

- Recipientes para cultivos: Placas de Petri, Multiplacas, Frascos de Roux de diferentes formas y tamaños o Especiales, como las «roller bottles» o con portaobjetos

Protocolos de trabajo en cabina de flujo laminar y en poyata de laboratorio.

- Inicio del trabajo en cabina: encendido y puesta a punto de la cabina, desinfección y recomendaciones para el trabajador.

- Durante la manipulación: distribución del material y utilización de la zona de trabajo, control del flujo y turbulencias de aire, actuación ante un vertido de material contaminado y alarmas.

- Al finalizar el trabajo: Limpieza, vaciado de material, apagado y cerrado de la cabina

- Mantenimiento: semanal (limpieza y desinfección de superficie y paredes, mensualmente (revisión de válvulas interiores) y anualmente se certificará por una entidad cualificada.

- Mesa de trabajo o poyata de laboratorio: orden, limpieza y desinfección

Protocolos de manejo de placas de cultivos.

- Apertura del material estéril dentro de la cabina

- Marcaje de las placas en la tapa y en un lateral de la base, de manera distinta para cada placa, para evitar intercambiar tapas.

- Toma del medio con la pipeta y transferencia a la placa entreabierta (no retirar la tapa)

- Tratamiento como residuo según riesgo biológico del cultivo

Áreas de un laboratorio de cultivo de tejidos.

- Área de preparación de medios: equipamiento

- Área de limpieza y esterilización: dimensiones mínimas, organización y equipamiento (máquinas de lavado de material y esterilizadores)

- Área de transferencia: cabina de flujo laminar/seguridad biológica y otros equipos

- Área de incubación o cámaras de crecimiento: control de iluminación, temperatura y humedad. Alarmas

Lavado, esterilización y preparación de materiales:

- Vidrio: pipetas, probetas, vasos, matraces y botellas de vidrio para preparación, almacenamiento y clasificación de medios y reactivos

- Plástico: Cultivos en placas y botellas, tubos de ensayo para diferentes técnicas y preparación de alícuotas de los reactivos

- Lavado, preparación y esterilización del material: área específica del laboratorio, con el método y desinfectantes adecuados

- Métodos de esterilización: Calor directo, flameado; Calor seco, Horno Pasteur y Calor Húmedo, Autoclave

Contaminaciones cruzadas y microbiológicas y su prevención.

- Principales contaminantes: microorganismos, otras líneas celulares del laboratorio y contaminación química

- Fuentes de la contaminación accidental: origen del cultivo tejido o células, proceso de manipulación del cultivo, empleo de reactivos biológicos contaminados, material contaminado y ambiente de trabajo

- Prevención para evitar contaminaciones: obtener siempre los cultivos de centros reconocidos que certifiquen el origen; trabajar bajo unas correctas normas de trabajo, limpieza y esterilidad, utilización de Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos), etc.

Características y naturaleza del sustrato en cultivos celulares.

- Tipos de sustratos

- Factores de adhesión celular

- Interacciones células-substrato: Medios semisólidos: matrices.

- Métodos de disgregación celular: mecánicos, químicos y enzimáticos

Medios y reactivos de cultivo celular. Características principales, preparación y renovación.

- Características de los medios de cultivo celular: composición, osmoralidad, viscosidad, tensión superficial, especificidad, pH, capacidad tamponadora, esterilidad, etc.

- Componentes y suplementos: Agua, sales, glucosa, aminoácidos y vitaminas. Suero, factores de crecimiento y otros suplementos específicos. Indicador de pH. Pautas par el suplemento con antibioticos

- Tipos de medios. Medios libres de suero.

- Opciones para la elección, en polvo, líquido concentrado o listo para usar

- Preparación de medios líquidos, a partir de polvo (filtración) o esterilizados en autoclave

- Opciones para la elección, en polvo, líquido concentrado o listo para usar

- Preparación de medios líquidos, a partir de polvo (filtración), concentrados o esterilizables en autoclave

Factores de crecimiento y supervivencia de células en cultivo.

- Hormonas y factores de crecimiento

- Suero. tipos; suero de ternera (CF), suero bovino fetal (FCS) el suero de caballo (HS) y suero humano (HuS). Sustitutivos del suero

- Factores que afectan a la supervivencia de las células en un cultivo

Técnicas de mantenimiento de células en cultivo. Criopreservación de líneas celulares y métodos de identificación. Productos de criopreservación celular.

- Proceso de almacenamiento por congelación con agentes crioconservantes (glicerol, DMSO,...).

- Disminución progresiva de temperaturas hasta utilizar depósitos con nitrógeno líquido. Sistemas automáticos para la reducción progresiva y controlada de la temperatura.

- Factores que se favorecen con la criopreservación

- Identificación: Datos mínimos de indentificación de cada vial

- Procedimiento de descongelación

Empleo de cultivos celulares con fines experimentales. Detección de actividad metabólica y toxicológica.

- Aplicaciones: estudio de las propias células, clonación, el cáncer, biología del desarrollo, investigación en biología celular y bioquímica, en farmacología y toxicología, obtención de anticuerpos u hormonas, técnicas diagnósticas, etc.

- Ventajas de la utilización de cultivos celulares en el campo de la toxicidad

- Limitaciones de los ensayos in Vitro para estudios de toxicidad

- Ensayos utilizados en pruebas de citotoxicidad: Pruebas citológicas: observación al microscopio, Pruebas bioquímicas. Pruebas de viabilidad (de respuesta inmediata o de corto plazo y de respuesta a largo plazo o de supervivencia)

- Células asesinas

- Requisitos de las pruebas de citotoxicidad

- Preparación de las células efectoras y diana

- Prueba de citotoxicidad

- Resultados e interpretación

SCORM 3. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES CON ÓRGANOS AISLADOS, TEJIDOS Y CÉLULAS ANIMALES

Experimentos con cultivos de tejidos de origen animal mediante su exposición a sustancias o elementos terapéuticos o tóxicos.

- Estudios del efecto de diferentes sustancias en cultivos con tejidos y órganos diana. Aplicaciones

- Estudios del efecto de diferentes sustancias en cultivos de células (primarias o líneas establecidas). Aplicaciones

Técnicas de valoración del crecimiento y la viabilidad celular.

- Rojo neutro

- Prueba MTT

- Liberación al medio de la láctico deshidrogenasa (LDH)

- Ensayos de fluorescencia

- Toxicidad relativa: (concentración efectiva en el 50 % de las células)

Recolección de células y sus productos.

- Recolección de las células de los cultivos: centrifugación continua o filtración y extracción en régimen continuo

- Sistemas cromatográficos para el aislamiento y purificación de las toxinas. Equipos relacionados

Prevención de riesgos laborales en la manipulación de órganos, tejidos y células.

- Principales riesgos biológicos

- Evaluación de riesgos: Propiedades intrínsecas del cultivo celular, como resultado de la modificación genética, como resultado de una infección con agentes patógenos. Condiciones de trabajo

- Normas de trabajo en los laboratorios de cultivos celulares

SCORM 4. INSTRUMENTACIÓN Y MÉTODOS DE REGISTRO DE SEÑALES A PARTIR DE ÓRGANOS AISLADOS, TEJIDOS Y CÉLULAS ANIMALES

Procesamiento de señales:

- Esquema general: transductor, amplificador y sistema de registro

- Equipos de espectroscopia de Bioimpedancia eléctrica

- Equipos de medida de la biomasa

Transductores: de fuerza, de presión, de temperatura.

Electrodos para biopotenciales y bioquímicos.

Ruidos en la salida de datos y métodos de filtrado.

Programas informáticos de recogida de datos.